[摘要] 目的 观察骨肉瘤患者Ⅰ型胶原α1（COL1A1）基因多态性，探讨骨肉瘤与COL1A1基因多态性的相关性。 方法 收集骨肉瘤以及正常患者外周血样本，应用焦磷酸测序方法（Pyrosequencing）对54例骨肉瘤患者与126例健康对照者COL1A1基因rs1061970位点进行分析。 结果 54例骨肉瘤患者COL1A1rs1061970位点基因型频率中，TT（13.0%）和CT（48.1%）要显著高于正常对照组TT基因型频率11.9%及CT等位基因频率30.2%（P<0.05），骨肉瘤患者组中T等位基因的频率为37.0%，高于对照组的27.0%，OR为1.59，95%CI 0.99～2.57，差异无统计学意义（P>0.05），但是骨肉瘤的发病风险仍呈上升趋势。 结论 COL1A1基因多态性与骨肉瘤的发生具有相关性，携带COL1A基因T等位基因的发生骨肉瘤的风险增高。
[关键词] 骨肉瘤；Ⅰ型胶原；基因多态性
[中图分类号] R966；R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）03-0019-04
骨肉瘤作为好发于青少年的恶性肿瘤，手术方法多为广泛切除或者截肢，导致致残致畸，患者后续生活质量较差，故而早期预警、诊断以及治疗变得异常重要。近年研究结果显示，胶原在骨组织中除了对结构蛋白起到支持作用外，还可以深刻影响骨细胞的分化[1]、增殖[1]、粘附[2，3]以及形态发生[4]，而且和癌细胞的骨转移也息息相关[5-7]。正常的骨组织中，90%的骨基质由Ⅰ性胶原构成，而软骨中以Ⅱ型胶原为主。骨肉瘤发生时候，胶原的含量以及类型的变化可能影响骨肉瘤的分类、分化以及预后，有研究显示[8]，Ⅰ型胶原的表达在不同分化水平的骨肉瘤中表达有显著差异，因此，可作为骨肉瘤分化以及恶性程度判断的参考标准。Ⅰ型胶原α1（COL1A1）基因主要编码Ⅰ型胶原的α1链，是构成3股螺旋链不可或缺的一部分。该基因启动子和UTR区域具有单核苷酸多态性（SNP），某些位点的SNP不仅引起单核苷酸碱基的改变，最后可导致蛋白表达和构象变化，这种变化目前已被证实可能与许多疾病密切相关，比如高度近视[9]、肝纤维化[10]、骨矿物质密度和矿物质转换[11]以及椎间盘疾病[12]。骨肉瘤作为结缔组织病的一种，相关的风险基因尚缺少系统研究，因此，对COL1A1基因多态性与骨肉瘤易感性关系的研究，将有助于更好地为提示患者患病风险提供预警。
1 资料与方法
1.1 临床资料
于2008年1月～2013年12月期间，收集研究对象血液或石蜡切片。126例健康对照者来自我院体检中心，其中男80例，女46例，年龄（25±10）岁。54例骨肉瘤患者来自我院骨科病房，其中男39例，女15例，年龄7～35岁，平均（20±10）岁，两组患者年龄和性别的差异无统计学意义。骨肉瘤患者组纳入标准为经过临床、影像及病理学（穿刺或者组织活检）确诊为骨肉瘤；排除标准：有遗传性肿瘤综合征史。病理类型：骨母细胞、软骨母细胞亚型 39例，纤维母细胞型及混合型 15例；肿瘤位置：上肢骨 16例，下肢骨 38例；Enneking GTM分期：ⅠA、ⅠB期 9例，ⅡA、ⅡB、Ⅲ期 45例；转移：有转移 14例，无转移 40例；治疗方式：截肢 18例，保肢36例。
1.2 DNA提取
每例研究对象取外周静脉血4 mL或者取其石蜡组织切片。全血使用2%EDTA抗凝，运输至实验室后，常规苯酚-氯仿法提取DNA，所取DNA溶于TE溶液，检测纯度和含量。取部分DNA模板4℃冰箱保存备用，其余的分装后-20℃冻存，石蜡包埋样本利用Qiagen公司QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒中提取说明进行，切片厚度在5 μm以上。
1.3 基因多态性检测
COL1A1基因SNP检测：采用聚合酶链反应结合焦磷酸测序（PCR-Pyrosequencing）方法进行COL1A1基因型检测，COL1A1 rs1061970基因型，扩增含该多态位点的PCR引物序列为5′-TGT TCC TTT TTG TTC AAA GTC TAT-3′和biotin-5′-AAA ATT CAC AAG TCC CCA TCC-3′，测序引物为：5’-ttattccttgatattttttc-3’，产物为88bp。PCR反应体系为25 μL，包括Taq聚合酶1U，MgCl2 2.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各0.2 μmol/L，DNA模板。PCR条件为：95℃预变性3 min，然后94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s进行30个循环后，72℃延伸8 min。取适量PCR产物进行单链化，结合测序序列后使用SNP检测通用试剂盒PyroMarkR. Gold Q96，用焦磷酸测序仪（PyroSequencer，Qiagen）进行检测。每一批PCR反应均以蒸馏水替代DNA模板作为阴性对照，并随机抽取10%的DNA标本进行二次分析以验证分析方法的正确性。
1.4 统计学方法
根据 Hardy-Weinberg平衡定律（H-W平衡定律），按以下公式计算各基因型理论频数：CC=np2，CT=2npq，TT=nq2，其中n为样本量，p、q分别为相应的等位基因频率，分别对骨肉瘤患者组及正常人群组分布进行SNP群体代表性检验。以χ2检验比较各基因型频率在病例组与对照组之间的差异。以比值比（oddsratio，OR）及其95%可信区间（confidenceinterval，CI）表示各种基因型发生骨肉瘤的风险度。OR值以非条件Logistic回归计算，并经性别、年龄状况校正。统计学分析用SPSS 10.0版（SPSS Inc.， Chicago， IL）进行。
2 结果
2.1基因分型结果
COL1A1基因位于17号染色体上，具体位置为17q21。rs1061970 位于UTR区域的多态性，直接影响到翻译的效率，COL1A1扩增产物片段长度为88 bp，利用带biotin的引物扩增该片段后，制备成单链用于焦磷酸测序，该法简便易行，操作简单，可实现高通量检测。检测发现患者组合对照组基因型频率和等位基因频率分布符合H-W平衡定律，并且两者频率分布之间差异有统计学意义（P=0.04）。从而提示，COL1A1基因rs1061970位点多态性与骨肉瘤的发生有明显相关。表1中骨肉瘤患者与正常对照组COL1A1 rs1061970位点基因型分布和基因频率比较经过H-W平衡检验在基因型频率出现上无显著差异。正常人群和骨肉瘤患者COL1A1基因多态性见表1。经检验两者在基因型频率和等位基因频率之间的差异有统计学意义（P<0.05）。由此可见，COL1A1 rs1061970基因多态性与骨肉瘤的发生有相关性。根据位点T所占人数/总人数（位点T人数+位点C人数），基因位点T在骨肉瘤患者中的比例（37.0%）要高于正常对照（27.0%），疾病风险比为1.59，95%CI为0.99～2.57，尽管两组之间无统计学差异（P=0.056），但是携带T型的患者发生骨肉瘤的风险增加。
表1 骨肉瘤患者和正常对照组基因分布以及关联分析
注：T/T、C/T和C/C分别为COL1A1基因rs1061970位点TT型、CT型和C型；基因位点T的计算为T/T人数×2+C/T人数，基因位点C的计算为C/C人数×2+C/T人数
2.2 骨肉瘤患者 COL1A1基因多态性在各临床亚组中的分布差异
随后我们针对骨肉瘤患者不同基因型与临床不同因素进行分层分析，结果显示rs1061970位点与年龄、性别、病理类型、疾病的发生部位以及GTM分期差异均无统计学意义，而与患者有无转移存在显著差异，rs1061970位点三种基因型频率分布与无转移组的差异有统计学意义（P<0.01），说明rs1061970基因型分布在转移与非转移组中存在差异；进一步对有转移组C、T等位基因频率分布与无转移组进行统计，结果显示差异无统计学意义（OR=2.111，95%CI：0.853～5.225，P=0.102），但是携带T的患者发生转移的风险增加。见表2。
表2 骨肉瘤患者COL1A1基因rs1061970位点基因型分布与发病风险的分层分析（n）
3 讨论
骨肉瘤是异质性比较强的疾病，其预后往往受到多种因素的影响，目前专门针对骨肉瘤预后的生物标志物主要有APE1、VEGF、mTOR、EGFR、PARP1、OGG1、BRCA1、ERCC1、XRCC1等，但是由于潜在标志物特异性不强，且多为基因表达分析，有一定波动性，因此，在一定意义上限制了临床上应用，亟待探索其他相关标志物，用于骨肉瘤的预后判断。COL1A1基因也就是编码Ⅰ型胶原α1亚单位的基因，不少研究提示该基因某些非编码区域位点多态性可能和多种疾病有关，比如研究显示和转录因子Sp1结合的位点多态性与绝经后妇女腕关节骨折有关[13]，从一定意义上证实这个基因SNP和骨代谢的关系。研究发现，COL1A1的多态性与骨肉瘤的易感性密切相关[14]，本研究从另一个角度揭示位点T与骨肉瘤的发生风险和转移风险存在一定的相关性。COL1A1基因rs1061970位点基因多态性是由胸腺嘧啶核苷酸（T）替代咆嘧啶核苷酸（C）而形成，该区域处于3’-UTR位置，多态性存在可能影响翻译的效率。本研究显示，COL1A1基因3’UTR区域T→C的多态性在骨肉瘤患者以及正常对照中的基因频率存在差异，进一步通过C和T分布频率分析显示，证实了 COL1A1 rs1061970位点的TC和TT，可能是风险性因素，存在这2个位点的患者骨肉瘤的易感性和转移风险增加。而CC和CT，可能是保护性因素，但是两组差异仅在SNP分布频率上具有统计学意义，而C和T之间不具有统计学意义。该基因多态性可能调控着COL1A1基因的翻译。我们也将临床因素和该位点多态性进行关联分析，结果发现该位点多态性主要与转移有关，而和患者的病理类型、发生部位、年龄、GTM分期和性别都没有显著相关性，进一步说明TC和TT可能是骨肉瘤转移的风险因素，后续对于该位点与骨肉瘤转移的功能的深入分析，将为我们阐明COL1A1对骨肉瘤细胞转移相关生物学功能的影响。此外，有研究显示，在骨肉瘤患者的外周血中发现，存在COL1A1 mRNA高表达的患者[15]，最后都发生了转移，在一定程度上提示，COL1A1的表达和患者预后存在负相关。然而，在肝癌中的研究中表现为COL1A1低表达的患者预后较差，并被认为是一个潜在的存活因子[16]。以上结果在一定程度上提示，COL1A1在不同肿瘤中对肿瘤预后的影响存在差异。因此，进一步研究将通过点突变的形式明确该位点变化对COL1A1表达的变化，以及通过大样本人群的检测探讨COL1A1表达以及SNP变化和患者预后的相关性，并探讨可能在上面结合的转录因子位点，以期最后明确该基因位点多态性和骨肉瘤生物学功能的关系。
另外，本研究首次利用焦磷酸测序仪检测COL1A1基因多态性和骨肉瘤相关性。焦磷酸测序可以用于SNP，甲基化以及未知序列的检测，尽管读长只有5～60 bp，但是操作简单，成本相对普通的一代和二代测序比较有优势，现在已经有不少商品化的基于焦磷酸测序平台的试剂盒已经开发出来，比如EGFR、Kras的检测试剂盒[17]，用于非小细胞肺癌替尼类药物的伴随诊断。因此针对若干已知位点的快速检测可以考虑焦磷酸测序平台，不仅可实现高通量而且单个样本的检测成本较有优势。
在本研究中，也存在许多不足之处，由于骨肉瘤的发病率较低，本实验中患者的样本收集较少，研究的患者均来自同一所医院，使得研究样本有较大的局限性，实验只有1个位点，应该在不同地区和种族中进行大样本数据分析，并联合多个SNP位点进行多中心研究，以最终明确COL1A1基因多态性与骨肉瘤的敏感性。
[参考文献]
[1] Cheng Y，Ramos D，Lee P，et al. Collagen functionalized bioactive nanofiber matrices for osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells： Bone tissue engineering[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology，2013，（2）：287-298.
[2] Teixeira S，H. Fernandes M，P. Ferraz M，et al. Proliferation and mineralization of bone marrow cells cultured on macroporous hydroxyapatite scaffolds functionalized with collagen type I for bone tissue regeneration[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2010，（1）：1-8.
[3] Kuo Y C，Yeh C F. Effect of surface-modified collagen on the adhesion，biocompatibility and differentiation of bone marrow stromal cells in poly（lactide-co-glycolide）/chitosan scaffolds[J]. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2011，82（2）：624-631.
[4] Liu L，Qin C，Butler W T，et al. Controlling the orientation of bone osteopontin via its specific binding with collagen I to modulate osteoblast adhesion[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2007，80（1）：102-110.
[5] Olsen B R. Morphogenesis：Collagen it takes and bone it makes[J]. Current Biology，1996， 6（6）：645-647.
[6] Tamiya M，Tokunaga S，Okada H，et al. Prospective study of urinary and serum cross-linked N-telopeptide of type I collagen（NTx） for diagnosis of bone metastasis in patients with lung cancer[J]. Clinical Lung Cancer，2013，14（4）：364-369.
[7] Tamiya M，Suzuki H，Kobayashi M，et al. Usefulness of the serum cross-linked N-telopeptide of type I collagen as a marker of bone metastasis from lung cancer[J]. Medical Oncology，2012，29（1）：215-218.
[8] Zhao H，Han K L，Wang Z Y，et al. Value of C-telopeptide-cross-linked Type I collagen， osteocalcin，bone-specific alkaline phosphatase and procollagen Type I N-terminal propeptide in the diagnosis and prognosis of bone metastasis in patients with malignant tumors[J]. Medical Science Monitor，2011，17（11）：CR626-CR633.
[9] 张惠忠，丘距世. 人骨肉瘤组织中Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型胶原基因的表达[J]. 肿瘤，2002，22（6）： 463-465.
[10] Inamori Y，Ota M，Inoko H，et al. The COL1A1 gene and high myopia susceptibility in Japanese[J]. Human Genetics，2007，122（2）：151-157.
[11] Zhao Y P，Wang H，Fang M，et al. Study of the association between polymorphisms of the COL1A1 gene and HBV-related liver cirrhosis in Chinese patients[J]. Digestive Diseases and Sciences，2009，54（2）：369-376.
[12] Kostik M M，Smirnov A M，Demin G S，et al. Genetic polymorphisms of collagen type I α1 chain（COL1A1） gene increase the frequency of low bone mineral density in the subgroup of children with juvenile idiopathic arthritis[J]. The EPMA Journal，2013，4（1）：1-8.
[13] Tilkeridis C，Bei T，Garantziotis S，et al. Association of a COL1A1 polymorphism with lumbar disc disease in young military recruits[J]. Journal of Medical Genetics，2005，42（7）：44.
[14] He M，Wang Z，Zhao J，et al. COL1A1 polymorphism is associated with risks of osteosarcoma susceptibility and death[J]. Tumor Biology，2014，35（2）：1297-1305.
[15] Wong I H N，Chan A T，Johnson P J. Quantitative analysis of circulating tumor cells in peripheral blood of osteosarcoma patients using osteoblast-specific messenger RNA markers：A pilot study[J]. Clinical Cancer Research，2000，6（6）：2183-2188.
[16] Hayashi M， Nomoto S， Hishida M， et al. Identification of the collagen type 1 alpha 1 gene （COL1A1）as a candidate survival-related factor associated with hepatocellular carcinoma[J]. BMC Cancer，2014，14（1）：108-110.
[17] 王树新，徐林富，王良明，等. 焦磷酸测序和双脱氧测序法检测结直肠癌患者K-ras基因突变的对比研究[J].肿瘤学杂志，2012，18（5）：339-341.
（收稿日期：2014-09-15）