基质辅助激光解吸电离飞行质谱技术联合纳米磁珠在宫颈癌早期诊断中的应用性研究

【第一作者简介】马琴飞(1976-)，男，主管技师，主要从事细菌生化

研究。

【摘要】目的:探讨蛋白指纹图谱技术筛选宫颈癌患者血清中可用于诊断的特异性蛋白标志物。方法:采用弱阳离子纳米磁珠微球捕获的蛋白，用PBSⅡ-C型蛋白芯片阅读仪检测绘制成蛋白指纹图谱。所有蛋白指纹图谱采用Bomarker Wizard软件分析之后，用Biomarker Pattern软件识别最终用于诊断的蛋白标志物，并优化组合建立诊断模型。结果:在宫颈癌与对照组之间找到74个差异蛋白峰(P<001)，其中质荷比（m/z）为3947 Da,4175 Da,5906 Da的蛋白峰组成的诊断模型可以将宫颈癌患者和健康志愿者区分，敏感性达940%(47/50),特异性为908%(59/65)。经双盲实验验证，该模型对宫颈癌诊断的敏感性达905%(38/42),特异性为960%(48/50)。结论:MALDI-TOF-MS技术联合纳米磁珠可以用来检测宫颈癌血清中的特异性蛋白标志物，并建立敏感性和特异性均较高的宫颈癌诊断模型。

【关键词】宫颈癌;蛋白指纹;诊断

Application of MALDI-TOF- MS combined with wcx magnetic beads in early diagnosis of cervical cancerMA Qinfei, SUN Lingfen. Clinical Laboratory of Taizhou Municipal Hospital, Taizhou 318000, China

【Abstract】Objectives: To screen the potential protein biomarkers in serum for the diagnosis of cervical cancer by protemic fingerprint. Methods: Proteomic fingerprint combining magnetic beads with MALDI-TOF-MS was used to profile and compare the serum proteins of patients with cervical cancer and healthy volunteers. PBSII-C protein chips reader was used to analyze protein peaks for significant difference. The protein fingerprint expression of all the serum samples and the resulting profiles between cancer patients and volunteers were analyzed with Biomarker Wizard system. Results： Seventy-four differentially expressed proteins in serum were screened between patients with cervical cancer and health individuals (P<0.01). Proteins (3974 Da, 4175 Da, 5906 Da) were used for building a clinprot model which was able to classify patients with cervical cancer and health individuals with a sensitivity of 94.0%(47/50) and a specificity of 90.8%(59/65). Blind test data indicated a sensitivity of 90.5% (38/42) and a specificity of 96.0% (48/50). Conclusion: The biomarks in serum for cervical cancer can be discovered by MALDI-TOF-MS combining with magnetic beads, which is a powerful and reliable diagnostic method for cervical cancer with a high sensitivity and specificity.

【Key words】Cervical cancer; Protein fingerprinting; Diagnosis

【中图分类号】R737.33【文献标志码】A

在乳腺癌之后宫颈癌是全球妇女中的第2个最常见的恶性肿瘤。妇女中每年宫颈癌新发现的病例约50万，估计中国新发的患者为131500例约占全世界范围的288%\[1\]，并且在相对年轻的妇女中发病率有增高的趋势。宫颈癌早期发现五年存活率高于7093%\[2\]。早期诊断是提高患者生存率和生活质量的关键。至今，用于提高宫颈癌的早期诊断及随访中病情监测的理想的肿瘤标志物尚未发现。鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen SCC-Ag)证实是有助于预后和随访监测的，但其灵敏度仅限于30%~40%。目前绝大多数肿瘤的发现是基于蛋白质的鉴定，经典发现肿瘤相关蛋白质的实验方法是双向凝胶电泳2D-PAGE\[3\]。由于双向凝胶电泳要求大量的蛋白质，而且不容易转变成诊断实验，蛋白指纹图谱技术鉴于其高灵敏性和高特异性得到广泛的应用。本文就基质辅助激光解析离子化飞行质谱(MALDI-TOF-MS)技术在宫颈癌早期诊断中的应用价值进行探讨和研究。

1材料与方法

11研究对象

92例宫颈癌(44例宫颈浸润癌，48例宫颈原位癌)患者术前血清标本来自台州市立医院及温州医学院附属第二医院，年龄26～65岁，中位年龄451岁；65例宫颈良性疾病组（22例急性宫颈炎，28例慢性宫颈炎，15例宫颈息肉），患者年龄在25～63岁，中位年龄421岁；与50名健康志愿者（年龄在25～64岁，中位年龄37岁）的外周血作为对照，宫颈良性疾病患者与健康志愿者血清来自台州市立医院。

12仪器和试剂

Sigma公司试剂：Tris-HC1、三氟乙酸尿素、DTT、SPA(Sinapinic acid)、CHAPS、乙腈、H2O等，美国Ciphergen Biosystems公司MALDI-TOF-MS(PBS IIC)质谱仪。北京赛尔迪公司弱阳离子交换型(WCX)纳米磁珠等。

13标本

抽取患者静脉血，于4℃ 下3000r/min离心10min，PCR管中分装，置-80℃内冰箱保存。

14前处理

依次加入20μL 9mol/L缓冲液(20g/L CHAPS 9mol/L尿素，50mmol/L Tris-HC1，10g/L DTT，pH90)和血清l0μL，并将样品混匀离心。室温静置10min，加入100mmol/L（NaAc，pH40)结合缓冲液混匀。

吸取分装PCR管中WCX纳米磁珠的液体，加入结合缓冲液并混匀，放置5min，重复以上操作1次。将100μL稀释好的血清样品加入到每个装有纳米磁珠的PCR管中，混匀后放置15min。在磁性处理器上吸去PCR管中未结合样品。再次重复以上操作。10μL洗脱液加入并混匀5min后，上清液5μL加入5μL饱和SPA溶液充分混匀，吸取1μL到Au芯片上点样，干燥后仪器检测读取数据。

15数据采集

PBS llc质谱仪，NP20芯片校准，误差为：<01％。参数设置：优化范围2000～20000，最高分子质量50000，检测灵敏度8，激光强度190，芯片上每个点的采集次数为80。收集数据软件：Ciphergen Protein Chip 321。

16数据分析

宫颈癌诊断模型的建立：血清来自宫颈癌患者50例和对照组55例（其中宫颈良性疾病35例、健康者20例），Biomarker Wizard软件筛选差异峰，建立诊断模型。扩充标本量，进一步验证诊断模型：血清的指纹图谱数据分析（宫颈癌患者42例和对照组50例其中宫颈良性疾病30例、健康者20例），评价该模型的准确性：灵敏度、特异性。

2结果

21建立诊断模型

建立建模组样本50例宫颈癌患者血清和55例对照血清蛋白质谱,在宫颈癌组与健康对照组间共发现74个蛋白有显著性差异(P<001)，见表1。检测范围为分子量2000~50000，用Biomarker Pattern软件进一步分析这些血清差异表达蛋白，并建立诊断模型：由3947 Da,4175 Da,5906 Da3个差异峰组成的，见图1。用此模型分析50份宫颈癌样本质谱，结果敏感性达940%(47/50),特异性为908%(59/65)，见表2。根据差异蛋白及其特定组合，理论上可以区分宫颈癌与对照组患者ROC曲线，见图2。

22盲法验证

盲法验证：宫颈癌患者42例与对照组50例（30例宫颈良性疾病组、20例健康者）检测得到的蛋白指纹图谱队对已建立的宫颈癌诊断模型进行验证，结果宫颈癌诊断的敏感性达905%(38/42),特异性为960%(48/50)。见表2。表1宫颈癌组与对照组间存在的74个差异蛋白m/zpm/zpm/zpm/zpm/zpm/zp2866.91E-105844.13.3E-095337.46.16E-083217.11.2E-051409.750.000577936.90.00453974.4*1E-101655.63.6E-094966.42.6E-075990.41.7E-053316.2870.000842934.70.00564175.8*1E-105067.88.1E-094114.65.6E-074135.92.1E-0546592.320.0008437004.20.00562043.32E-104648.39.6E-093158.26.6E-075706.66.2E-057980.9680.00093410273.90.00625217.42E-105592.69.6E-098149.46.6E-0711105.80.000142757.5680.00117844.30.00745637.33E-105906.4*1.75E-082640.11.8E-069070.60.0001615640.880.00126885.070.00813086.54E-105808.72.26E-088054.12.1E-066999.60.0002043357.520.00157570.710.008413681.34E-107629.92.26E-083815.85.4E-0616329.80.000244384.1670.001615331.510.009214284.24E-105546.43.45E-083933.66.7E-063371.10.000275481.3240.00199197.910.009612011.96E-105862.73.45E-087773.27.7E-0616107.20.0004333319.360.0032N/AN/A3957.69E-106112.74.43E-083191.19.4E-0647398.20.000468079.5730.0035N/AN/A3288.91.2E-095195.85.22E-081388.11.1E-054348.90.000489296.6680.0035N/AN/A2541.23.3E-094529.86.16E-085267.81.2E-053262.10.0005415130.330.0043N/AN/A注:*为选为建立宫颈癌诊断模型的蛋白峰

图1建立宫颈癌诊断模型的3个蛋白峰（m/z3974, 4175, 5906）蛋白指纹图

表2宫颈癌诊断模型的诊断特异及盲法验证结果分组样本例数准确分类（例）准确率（%）训练集宫颈癌504794.0对照655990.8盲法集宫颈癌423890.5对照504896.0图2分类数模型的ROC曲线

3讨论

宫颈癌为常见的恶性肿瘤之一,据统计我国宫颈癌发病呈年轻化及升高趋势，严重威胁着人们的健康。传统的巴氏涂片检查在过去的半个世纪，为降低宫颈癌的发病率发挥了重大的作用，被认为是肿瘤防治学上最重要的成就之一。近年来研究发现巴氏涂片有较高的假阴性率15%~40%\[4\]。因此，寻找更为精确的特征性的蛋白标志物是早期诊断宫颈癌的当务之急。近年来，蛋白质组研究技术已被广泛应用到各种生命科学领域。MALDI-TOF -MS技术联合纳米磁珠是近年来出现的一种精确分子量测定和结构分析的新型平台\[5\]。相比强阴离子交换磁珠更多的蛋白质能被WCX磁珠结合捕获，此技术比SELDI-TOF MS技术更敏感，因为磁珠球表面面积比芯片的大，它更特异、重复性好，它已广泛地应用于肿瘤标志物的研究如乳腺癌\[6\]、胃癌\[7\]、肝细胞癌\[8\]、大肠癌\[9\]、胆囊癌\[10\]、垂体腺瘤\[11\]、妊娠期高血压疾病\[12\]，等\[13\]。

本文对宫颈癌患者和对照者血清中的蛋白指纹图谱采用(MALDI-TOF-MS)技术进行对比分析研究，结果显示诊断宫颈癌的最佳标志物分别是m/z为3947 Da,4175 Da,5906 Da的蛋白峰，由3个蛋白质峰组合成的诊断模型可以很好地将宫颈癌患者和对照组区分，敏感性达940%(47/50),特异性为908%(59/65)。经双盲实验验证，该模型对宫颈癌诊断的敏感性达905%(38/42),特异性为960%(48/50),其ROC曲线为930%。

经筛选的m/z为5906 Da的蛋白可能为纤维蛋白原内部片段α-E链，因为5906 Da非常接近于纤维蛋白原α-E链\[14\]的理论分子量5908 Da，它是严重急性呼吸道综合症（SARS）\[14\]和胃癌复发的阳性标志物\[15\]。其他两个标志物有待于在未来的研究中进一步探讨。

总之，本次采用WCX和（MALDI-TOF MS）技术联合应用生物信息学软件，尤其是由3个蛋白质峰组合成的诊断模型对宫颈癌的诊断具有较高的敏感性和特异性。所以，使用WCX磁珠结合质谱技术筛选出的特异性蛋白标志物，对于提高宫颈癌的早期诊断率有一定的意义，至于预后和治疗效果的监测的研究价值有待于进一步探讨。

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(收稿日期：2013-12-11)

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