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摘 要 傅里叶变换红外光谱显微成像（FTIRI）可同时获得样品的红外光谱和形貌信息，其与化学计量学方法结合，可实现生物组织中主成分含量及分布的定量研究。本研究采用FTIRI技术结合主成分分析（PCA）以及Fisher判别算法对正常和病变的关节软骨进行鉴别分析。对关节软骨切片进行实现FTIR扫描及光谱分析，再利用SPSS软件对软骨的光谱（矩阵）进行主成分分析，根据主成分得分矩阵构造分类函数，结合Fisher判别算法对样本进行分类识别。正常和病变的关节软骨样品识别准确率高达95.7%（初始案例）和94.3%（交互验证案例）。本方法可准确有效地辨别关节软骨是否发生病变，为监测骨关节炎的发生和修复提供参考。
关键词 关节软骨，傅里叶变换红外光谱，主成分分析，Fisher判别
1 引 言
关节软骨覆盖骨关节表面，能有效减少关节间的摩擦、承受机械压力和缓冲震动，在生命运动中发挥着重要作用[1]。关节软骨由软骨基质和软骨细胞组成。软骨基质的主要成分为II型胶原蛋白（Collagen）、蛋白多糖（PG，主要是硫酸软骨素CS6）、水和少量的无机离子等[2]。胶原蛋白构成软骨基质纤维网络的基本架构，并有效固定蛋白多糖[3]。蛋白多糖则能保证关节软骨的弹性和耐压性[4]。软骨基质外表面到潮线之间呈板层状结构，由连续的3层构成：表层区（SZ）、过渡区（TZ）和深层区（DZ）[5]。在3个分区内，基质主成分的含量及空间分布各不相同[6]。
年龄增长、外伤、负重等因素都可能改变软骨基质主成分的含量及空间分布，从而导致骨关节炎（OA）的发生[7，8]。OA早期主要表现为软骨基质主成分浓度以及软骨细胞形态和活性的改变，无明显的组织损伤出现[9]。这对OA的早期诊断造成极大困难。目前关于关节软骨的研究方法主要有：阳离子染色剂结合显微分光光度测量法[10]、荧光探针结合竞争酶联免疫吸附测定法[11]、生化分析法、磁共振成像（MRI）技术[12]等。但以上方法对于OA期间主成分微量变化的监测仍显不足。
傅里叶红外光谱显微成像（FTIRI）可同时实现样品的红外光谱采集和红外图像扫描。其图像的每个像素对应一个红外光谱，利用伪彩色表示该像素处的平均吸收率。FTIR图像形象直观地描述样品组分的结构及其特征基团的空间分布和含量变化[13～15]，将空间定位技术与定量分析能力有机结合，具有更高的空间分辨率、光谱分辨率及灵敏度。主成分分析（PCA）的宗旨是对复杂系统中的数据进行降维，将原变量转换成少数几个新变量，能够从光谱数据中提取主成分的半定量信息， 使研究的问题简单化，数据特征更明显，同时排除噪声影响。它可将光谱矩阵分解为主成分载荷和得分矩阵，其中得分矩阵表示主成分的相对浓度，而载荷矩阵表示主成分的归一化光谱[16]。Fisher判别是一种借助方差分析建立判别函数，对数据集进行快速分类的分析方法。其基本过程是根据已知类别的数据组构造判别函数，判别系数的确定原则是类间的协方差最大且类内的协方差最小。利用判别函数计算待鉴别样品的判别得分，通过与阈值比较，判别它的类属。Fisher判别的优势在于应用范围广泛，对各类分布及方差没有限制，能较好地适应复杂对象的鉴别分析[16]。
红外光谱技术结合PCA以及Fisher判别在生物医学领域已有应用研究的报道[17，18]。目前， 该方法尚未应用于关节软骨的相关研究中。本研究采用FTIRI结合PCA以及Fisher判别算法，对正常和病变的关节软骨样本进行鉴别分析。本方法为研究OA的发生和修复的实时监测提供参考。
2 实验部分
2.1 实验仪器
实验所用成像仪器是 PerkinElmer Spotlight300 FTIRI System （Wellesley， MA）。系统主要分为两部分：红外显微成像系统和傅里叶变换红外光谱仪。成像系统的探头由一个液氮冷却的16阵元MCT（汞镉碲化合物）焦平面阵列检测器和一个单点MCT检测器组成，可获得样本的红外吸收图像以及可见光图像。傅里叶变换红外光谱仪主要是由光源、迈克逊干涉仪、样品室、检测器和计算机组成。
2.3 光谱数据分析
PCA过程中，首先根据光谱矩阵计算协方差矩阵；接着计算矩阵的特征值和特征向量；然后根据特征值计算方差贡献率；最后计算主成分得分矩阵，以便进一步的Fisher判别。为了尽量减少研究对象数据信息的损失，又能减少变量和简化问题，选取累计方差贡献率达85%以上的前几个因子作为主成分。Fisher判别是通过对已知类属的样本变量进行变换（保证类内离散度尽可能小，类间离散度尽可能大）构建典型判别函数。根据判别函数计算样本聚类中心的欧氏距离，得到分类函数。将未知类属的样本数据代入分类函数，并根据结果将其归于欧氏距离最小的一类。PCA及Fisher判别采用SPSS 20软件完成。
3.2 主成分分析
PCA所得前4个主成分的累计贡献率如表1所示，前两个主成分的累计贡献率达到88.138%，能够表示光谱数据矩阵的大部分特征。主成分因子数的大小会影响Fisher判别模型的训练与预测结果，需要进一步优化以选择最佳因子数，建立Fisher判别模型。在不同因子数条件下，初始案例和交互验证案例的识别率不同。当主成分因子数为2时，初始案例的识别率达95.7%；交叉验证案例的识别率达94.3%。随着因子数的增加，样本的正确识别率平缓上升；当因子数为8时，正确识别率稳定在100%。综上，所提取的前两个主成分能够表示原光谱矩阵的大部分信息，极大地简化所需分析的数据量， 并且使得Fisher判别模型有较高的识别率和判别效率。
根据案例编号可知，误判案例多取自病变样本的TZ（#42， 43， 46）。个别案例误判的原因可能是：一方面，手术诱导后8周的病变样本中组分含量变化在SZ较明显，而在其它区域（如TZ）含量变化较小[23]；另一方面，误判案例所在区域内的软骨基质中有大小形态发生变化的软骨细胞的分布，相对于软骨基质，软骨细胞对红外光有较强的散射效应影响了模型对样本的识别，这也可能导致该模型的错误识别。此外，在本实验建模过程以及近期的一系列病变样本的研究中发现，主成分因子为2的情况下，均会得到两个二元一次函数，即分类函数。随着训练组数据量的变化，分类函数（公式（1）和（2）当中的得分系数也随之发生变化，但总识别率都比较高（接近95%），且初始案例和交叉验证的判别结果也十分接近，因此可以判断本研究建立的判别模型有稳定的可靠性。
4 结 论
利用FTIRI技术对正常和病变关节软骨样本进行成像，提取红外吸收光谱后，采用PCA对数据进行降维，再结合Fisher判别算法构建关节软骨的判别模型，以完成对样本的鉴别。结果表明，在主成分因子数为2的条件下，训练组初始案例总识别率为95.7%，交互验证案例总识别率为94.3%，预测组样本全部正确识别。其中，正常样本全部正确识别，只有个别病变样本案例出现误判。本方法能较为准确、可靠地对正常和病变的关节软骨进行鉴别，并为早期OA的研究提供了一种潜在的简便、快速、可靠的方法。
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