总结。光学宽视场显微镜最常用的显微技术有明场成像、暗场成像、相衬成像、偏光成像、微分干涉（DIC）成像、调制对比成像和荧光成像。相衬成像中根据不同的成像结构还有切趾相衬成像。微分干涉除了传统的偏振光照明还有圆偏振光照明（CDIC）和专用于塑料的微分干涉（PlasDIC）。共聚焦显微镜随着计算机技术和制造技术的发展而有了巨大的发展。除了传统的共聚焦荧光显微镜以外，还有连续反斯托克斯拉曼散射（CARS）共聚焦、多光子共聚焦和白光共聚焦。超分辨率显微镜中主要介绍了受激辐射淬灭（STED）技术和紧随基态淬灭显微技术的单分子返回（GSDIM）技术。
关键词：宽视场显微镜； 共聚焦显微镜； 超分辨率； 显微成像技术
中图分类号： O 435 文献标志码： A doi： 10.3969/j.issn.10055630.2015.06.017
Abstract：The imaging technology in modern microscope for widefield microscope， confocal microscope and superresolution microscope is outlined here. The most frequentlyused technology in the widefield microscope is brightfield， darkfield， phase contrast， polarization， DIC， modulation contrast and fluorescence. In phase contrast， there is also apodized phase contrast. In addition， DIC， CDIC and PlasDIC are also presented. Confocal microscope is developed greatly with the development of computer and manufacture technology. Besides conventional confocal system， the principle of coherent antiStokes Raman scattering（CARS） confocal，multiphoto confocal， white confocal are also explained in detail. As for superresolution microscope， the principle of stimulated emission depletion（STED） and ground state depletion microscopy followed by individual molecule return（GSDIM） are clarified.
Keywords：widefield； confocal； superresolution； microscope imaging technology
引 言
显微镜根据成像方式可以分为光学宽视场显微镜、共聚焦显微镜、体视显微镜[1]。光学宽视场显微镜和共聚焦显微镜更多地应用于生命科学研究，对成像的要求更高，而体视显微镜更多应用于工业领域，对数码化和人性化的要求更高[2]。本文主要阐述用于生命科学领域的显微成像技术，光学宽视场显微镜常用的显微技术有明场成像、暗场成像、相衬成像、偏光成像、微分干涉（DIC）成像、调制对比成像和荧光成像，共聚焦显微镜常用的显微技术有荧光、全反射、超分辨、多光子和白光共聚焦成像。
1 光学宽视场显微镜
在光学宽视场显微镜中的各种成像技术中，明场、暗场、偏光和荧光成像是为了使需要观察的标本结构可见，而相衬、微分干涉、调制对比成像是将标本结构中的相位变化显现出来。很多情况下几种成像技术同时使用。
1.1 明场成像和暗场成像
明场成像是最基本的显微成像技术，其他所有的成像技术都是以明场成像为基础的。明场成像光路如图1所示，光源通过集光镜和聚光镜聚焦到标本上，如果是临界照明，灯丝的像直接会聚到标本；如果是科勒照明，灯丝像会聚在聚光镜前焦面，由聚光镜再照射到标本上。透射过标本的光线由物镜收集在物镜后焦面上形成光瞳的像，光瞳的像是相对于空间的成像光线角度的分布，现代显微镜中多用这个位置进行各种对比方式的变化。经过后焦面后，光线进入镜筒透镜，镜筒透镜将相对于空间的角度分布变换为相对于空间的位置分布，即在镜筒透镜的后焦面形成中间像面。现代显微镜中，在镜筒透镜形成中间像面之前，会利用Cmount镜头转接中间像面到摄像头上，从而实现数码成像，便于现代教学和研究。最后中间像面由目镜成像到眼睛的视网膜上，从而看到放大的像。
暗场成像和明场成像只有照明光路有所区别。暗场成像是以超出物镜数值孔径的角度照明，标本由于大角度照明产生衍射光或者散射光，包含在物镜数值孔径内的衍射光或者散射光由物镜收集，按照明场光路投射到眼睛或者摄像头。暗场照明如图2所示，有两种方式：一种是透射式暗场照明，直接用中间不透光的圆环在聚光镜前焦面拦截光线；另一种是反射式暗场照明，暗场反射镜面安装在物镜外壳靠近标本的位置，光线经过暗场反射镜面以超出物镜数值孔径的角度入射在标本上，标本发出的衍射或者杂散光由物镜收集后成像。反射式暗场照明镜面有的是球面，有的是非球面，有的在照明光路中加上微透镜或者散射片，都是为了实现大面积均匀照明。
1.2 相衬成像
相衬成像光路如图3所示。相衬成像是在物镜后焦面或者后焦面的共轭位置，也就是光线角度相对于空间分布的位置（光瞳位置），选取某一环带的光线，将通过这一环带0级光线强度降低到和1级衍射光相同，再将0级光线的相位改变180°，和1级衍射光的相位相反。这样当光线在光瞳面进行相位和强度变换后，镜筒透镜将其按照空间位置合成，在中间像面就会凸显出由1级衍射光所表征的结构特征，同时由于0级光变弱，背景将比较暗。